Эпигенетические эффекты бисфенола А и фталатов

Введение

Пластик широко используется в современной жизни, и входящие в его состав несвязанные химические вещества – бисфенол A и фталаты – могут вымываться в окружающую среду. Бисфенол и фталаты в последнее время привлекли особое внимание научного сообщества, регулирующих органов и широкой общественности из-за их высокого объема производства, широкого использования и неблагоприятного воздействия на здоровье [1]. В настоящее время бисфенол используется в производстве поликарбонатных пластиковых ёмкостей, таких как бутылочки для детского питания, и эпоксидных плёнок, которыми покрывают внутренние металлические поверхности банок с пищевыми продуктами и напитками. Бисфенол также используется в качестве пластификатора для смягчения и повышения гибкости пластмассовых изделий из поливинилхлорида (ПВХ). Другое применение бисфенол нашёл в медицине – в стоматологических герметиках и композитных материалах, используемых в пломбах [2]. Однако воздействие может также происходить за счет кожного контакта с термобумагой, широко используемой в кассовых чеках.

Фталаты представляют собой группу аналогичных диэфиров фталевой кислоты, используемых в качестве пластификаторов для смягчения и повышения гибкости ПВХ-пластиков [2]. Человек повергается воздействию фталатов в основном через продукты питания – из-за их использования при обработке и упаковке пищи. При употреблении загрязнённых продуктов диэтилгексилфталат преобразуется кишечными липазами в моно-(2-этилгексил) фталат, который затем преимущественно абсорбируется. В качестве компонента латексных клеящих веществ используется дибутилфталат. Он также используется в косметике и других продуктах личной гигиены, в качестве пластификатора в целлюлозных пластиках и в качестве растворителя для красителей [4]. Монобутилфталат является токсичным метаболитом дибутилфталата и бутилбензилфталата.

Эпигенетика представляет собой исследование наследуемых изменений в экспрессии генов без изменений в последовательности ДНК. Эпигенетические механизмы включают метилирование ДНК, модификации гистонов (ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, убиквитинирование, сумоилирование и рибозилирование АДФ) и экспрессию некодирующих РНК (включая микроРНК). У млекопитающих шаблоны метилирования ДНК устанавливаются во время эмбриогенеза через взаимодействие ферментов ДНК-метилтрансферазы (DNMT) и связанных с ними белков. DNMT1 отвечает за поддержание шаблонов метилирования на протяжении всей репликации ДНК. DNMT2 может участвовать в эмбриональных стволовых клетках и потенциально в метилировании РНК. DNMT3A и DNMT3B участвуют в активном de novo метилировании ДНК на CpG-островах. Считается, что наибольшая чувствительность к эпигенетическим влияниям приходится на ранний период развития, поскольку скорость синтеза ДНК высока, и в это время происходит сложное взаимодействие метилирования ДНК и организации хроматина, необходимых для нормального развития ткани [5].

Эпигенетика может влиять на профили экспрессии генов большинства органов и типов клеток. Кроме того, эпигенетика является важным механизмом возможного влияния химических веществ окружающей среды на здоровье и болезни человека [6]. Поступающие извне химические вещества, такие как BPA и фталаты, могут играть определенную роль в этиологии рисков развития многих человеческих заболевания [5,7,8]. Несколько блоков доказательств, полученных из моделей in vitro и in vivo установили, что эпигенетические модификации, вызванные воздействием токсических веществ во внутриутробный период, могут вызывать изменения в экспрессии генов, которые могут сохраняться на протяжении всей жизни. Таким образом, вызванные окружающей средой эпигенетические изменения всё более соотносятся со здоровьем и болезнями человека [9-11].

За последние годы во многих исследованиях изучалась взаимосвязь между воздействием химических веществ окружающей среды и эпигенетическими эффектами, и были идентифицированы несколько токсинов изменяющих эпигенетические метки. Большинство проведенных до сих пор исследований были сосредоточены на метилировании ДНК, тогда как только в нескольких недавних исследованиях изучалось влияние химических веществ на модификации гистонов и экспрессию микроРНК [12]. Здесь мы рассмотрим данные об эпигенетических эффектах, а также токсикогеномике, токсичности и влияния на здоровье бисфенола и фталатов, полученные из моделей in vitro, исследований на животных и человеке.

Токсичность и воздействие на здоровье бисфенола А и фталатов

На протяжении длительного времени известно, что бисфенол и фталаты обладают слабыми эстрогенными свойствами и вызывают нарушение работы эндокринной системы. Это происходит из-за способности химических веществ конкурировать с собственными (эндогенными) стероидными гормонами, связываясь с их рецепторами. Бисфенол первоначально был открыт как искусственный эстроген, и его эстрогенный эффект использовался для активации быстрого роста крупного рогатого скота и птицы. В течении нескольких лет бисфенол также использовался в эстрогенной заместительной терапии для женщин. Поскольку бисфенол может слабо связываться с рецепторами эстрогена ESR1 и ESR2, он, вероятно, будет вызывать нарушения работы эндокринной системы. Последствия воздействия бисфенола на здоровье человека были широко рассмотрены в отчёте Национальной программы по токсикологии для оценки рисков для репродукции человека [13]. Существует обширная литература, показывающая неблагоприятные последствия острого воздействия низких доз бисфенола на экспериментальных животных [14,15]. В эпидемиологических исследованиях были обнаружены ассоциации между уровнями бисфенола в крови у женщин и ухудшением здоровья, включая гиперплазию эндометрия и ожирение [16]. Было показано, что воздействие бисфенола на ранних стадиях развития оказывает неблагоприятное воздействие на здоровье эмбриона, включая вторичные изменения полового развития и нейроповеденческие изменения [17]. Поскольку существует известное окно уязвимости к бисфенолу, в которое попадают развивающийся плод и дети, особую озабоченность вызывает повышенное воздействие бисфенола на беременных женщин и детей. Для них риск развития неблагоприятных последствий выше, чем для взрослых, подвергшихся воздействию тех же уровней бисфенола [14,18].

Последствия воздействия фталатов на здоровье человека также были предметом рассмотрения отчёта Национальной программы по токсикологии для оценки рисков для репродукции человека [19]. Имеется достаточные количество доказательств того, что воздействие фталатов имеет токсические последствия на развитие и репродукцию у грызунов. У людей дисморфологические расстройства репродуктивной системы, наблюдаемые у младенцев мужского пола, были в значительной степени связаны с перинатальным воздействием фталатов [20]. Было показано, что дибутилфталат/бутилбензилфталат/монобутилфталат оказывают значительное влияние на репродуктивное развитие у мужчин, если их воздействие происходит в критические периоды половой дифференциации (то есть в конце беременности). Фенотипические изменения, наблюдаемые у самцов крыс, подвергшихся воздействию фталатов в течение перинатального периода, имели удивительное сходство с распространенными нарушениями репродуктивной функции человека, включая крипторхизм, гипоспадию и низкое количество сперматозоидов [21]. Антиандрогенная активность смесей фталатов и бисфенола А демонстрирует взаимодополняющее действие. Они проявляют тенденцию к синергетической активности при высокой и антагонистической активности при низких концентрациях [22].

Биомониторинг бисфенола с помощью анализа крови и/или мочи крови может недооценивать общую нагрузку на организм этого потенциального токсина. Анализ пота следует рассматривать как дополнительный метод мониторинга биоаккумуляции бисфенола у людей. Искусственно вызванное потоотделение, по-видимому, является потенциальным методом устранения бисфенола из организма [23].

Токсикогеномика бисфенола А и фталатов

Согласно «Сравнительной токсикогенетической базе данных» бисфенол А и пять наиболее часто упоминаемых фталатов (диэтилгексилфталат/моно-(2-этилгексил) фталат и дибутилфталат/бутилбензилфталат /монобутилфталат) имеют 1232 и соответственно 265 взаимодействий с уникальными генами/белками [25, 26]. С помощью MetaCore было проведено сравнение 1232 уникальных генов/белков, взаимодействующих с бисфенолом с 265 уникальными генами/белками, взаимодействующими с пятью фталатами. Сравнение проводилось по базам компании GeneGo, включавшим в себя карты метаболических путей, процессы, сеть токсичности и заболеваний.

Было обнаружено, что общей мишенью для бисфенола и фталатов являются 89 генов/белков, результатом чего является сходная генная токсичность и неблагоприятное воздействие на здоровье человека. Десять основных метаболических путей GeneGo с наивысшей вероятностью были связаны с 89 общими генами/белками, взаимодействующими как с бисфенолом, так и с фталатами, тогда как те, которые взаимодействуют со специфичными для бисфенола или фталатов генами/белками, имели меньшую и небольшую вероятность. Пять из десяти основных GeneGo сетей токсичности, предсказанных 89 общими генами/белками, были вовлечены в процесс воспаления, на что важно обратить внимание, поскольку многие хронические заболевания человека вызваны иммунными и воспалительными дисфункциями [27]. Также интересно, что шесть из десять основных заболеваний, согласно картам GeneGo, являлись новообразованиями мужской и женской репродуктивной системы, эндометрия и молочной железы.

Помимо этого, дополнительно были проанализированы с использованием IPA (Ingenuity Knowledge Base) молекулярные и клеточные функции, физиологические системы развития и функционирования, заболевания и расстройства, связанные с 89 общими генами/белками, являющимися мишенями как бисфенола, так и фталатов. Было обнаружено что рак, нарушения развития и заболевания репродуктивной сферы составили три основных категории.

Наконец, эти 89 генов/белков могут служить в качестве биомаркеров для анализа токсичности бисфенола и фталатов, вымывающихся в окружающуюся среду из широко используемых пластмасс.

Эпигенетические эффекты бисфенола А и фталатов

Бисфенол A и фталаты являются эпигенетически токсичными. Эпигенетический эффект бисфенола был чётко продемонстрирован у жизнеспособных желтых мышей [28]. В результате воздействия бисфенола на беременную мышь цвет шерсти потомков стал жёлтым, что является результатом уменьшения метилирования CpG-островов в ретротранспонируемой последовательности, расположенной выше гена агути. Интересно отметить, что этот эффект метилирования ДНК и связанного с этим изменение цвета шерсти животных можно было предотвратить добавлением в корм матери пищевых добавок с источником метильной группы, таких как фолиевая кислота или фитоэстроген генистеин [29].

При внутриутробном и неонатальном воздействии низких доз бисфенола А и или фталатов может быть вызвано гиперметилирование/гипометилирование ДНК на CpG-островах вблизи областей промотора гена, гистоновые модификации (ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, убиквитинирование) и экспрессия некодирующих РНК, включая микроРНК. Эти эпигенетические метки могут вызвать увеличение или уменьшение экспрессии генов, которое может сохраняться на протяжении всей жизни. Результатом этих необратимых изменений могут быть неблагоприятные последствия для здоровья, такие как нейронные и иммунные расстройства, бесплодие и поздние комплексные болезни (рак и диабет). Кроме того, показано, что временное воздействие бисфенола и фталатов на кормящих самок крыс является причиной изменения метиляции ДНК у третьего поколения потомков.

Воздействие химических веществ, нарушающих работу эндокринной системы, вызывает особую озабоченность в свете развития организма. Неонатальное воздействие бисфенола на крыс приводило к увеличению частоты интраэпителиальной неоплазии предстательной железы, а ткани простаты демонстрировали последовательные изменения метилирования. Например, было обнаружено, что у крыс ген фосфодиэстераза тип 4 вариант 4 (Pde4d4) имеет гипометилирование на регуляторном CpG-острове, и повышенную экспрессию в ткани предстательной железы у взрослых животных [30,31]. Было показано, что неонатальное воздействие бисфенола индуцирует гиперметилирование зон промотора рецептора эстрогена в яичке крысы, что указывает на опосредованные метилированием эпигенетические изменения как один из возможных механизмов, которым бисфенол оказывает неблагоприятное влияние на сперматогенез и фертильность [33].

Показано, что бисфенол изменяет статус метилирования гена Hoxa10 у мыши при внутриутробной модели воздействия [34]. Внутриутробное воздействие бисфенола увеличивало экспрессию гомеобокс-последовательности Hoxa10 в матке самок потомства в возрасте двух недель. Это изменение экспрессии генов ассоциировалось с значительным деметилированием специфических CpG-островов как в промоторе, так и в интроне гена Hoxa10. Также были исследованы эффекты влияния бисфенола на метилирование ДНК в тканях мозга. Воздействие бисфенола на мать ассоциировалось либо с гипо-, либо с гиперметилированием связанных с промотором CpG-островов в нескольких локусах в мозге мышиного эмбриона [35]. Ген-специфические изменения были подтверждены в 13 локусах, а также были отмечены изменения состояния метилирования ДНК двух генов, кодирующих транспортные белки. Сообщалось, что воздействие на первичные эпителиальные клетки молочной железы человека низкой дозы бисфенола увеличивает метилирование ДНК на CpG-островах гена гликопротеина лизосомальной мембраны (LAMP3) и подавляет экспрессию этого гена [36].

Было обнаружено, что бисфенол воздействует на модификацию гистонов путём увеличения уровня экспрессии фермента гистон-метилтрансферазы «Enhancer of zeste homolog 2» (EZH2) в клетках линии MCF7 рака молочной железы человека, а также в клетках молочных желез шестинедельных мышей, подвергшихся воздействию бисфенола в матке [37]. Как in vitro, так и in vivo эти изменения были достигнуты путем увеличения триметилирования гистона H3 у лизина 27, который является основной модификацией гистонов, катализируемой EZH2 и обычно ассоциируется с экспрессией гена [38].

Относительно микроРНК (мРНК), было показано, что воздействие бисфенола на линии плацентарных клеток человека изменяет уровни экспрессии мРНК, и, в частности, miR-146a существенно индуцируется воздействием бисфенола. Это приводит как к более медленной скорости пролиферации, так и к более высокой чувствительности к поражающему ДНК агенту блеомицину [39]. Клетки Сертоли мыши линии TM4, подвергнутые воздействию бисфенола на 24 часа продемонстрировали двукратное увеличение или уменьшение 37 различных мРНК, причём большая часть мРНК уменьшилась под воздействием бисфенола [40].

Что касается фталатов, то обработка клеток линии MCF7 рака молочной железы человека бисфенолом приводило к деметилированию CpG-островов, ассоциированных с рецепторами эстрогена (ESR1), что указывает на то, что измененная бисфенолом экспрессия мРНК связана с ненормальным метилированием ДНК в промоторной области гена рецептора [41]. Было показано, что воздействие на мать диэтилгексилфталата увеличивает метилирования ДНК и уровень ДНК метилтрансферазы в яичках мышей. Яички являются основной мишенью для диэтилгексилфталата ещё на стадии эмбриона, о чем свидетельствует синдром неразвитости яичек, проявляющийся из-за уменьшения экспрессии инсулиноподобного гормона 3 (INSL3) и производства тестостерона [42].

Молекулярные механизмы, лежащие в основе долговременных эффектов воздействия бисфенола и фталатов по-прежнему выясняются, и они, вероятно, связаны с нарушением эпигенетической программы экспрессии генов во время развития. Важно определить, коррелируют ли эпигенетические маркеры в более доступных тканях с эпигенетическими маркерами в тканях-мишенях. Многие исследования явно указывают на то, что воздействие нарушающих работу эндокринной системы химических веществ может иметь кумулятивные неблагоприятные последствия для будущих поколений и что эти эффекты могут быть опосредованы эпигенетическими механизмами [43].

Наконец, было показано, что временное воздействие на беременных мышей в период внутриутробного определения пола эмбриона смесью пластиков (бисфенол и фталаты) приводит к раннему наступлению половой зрелости у потомков-самок (в третьем поколении), и уменьшению размера первичного пула фолликулов яичников. Через поколения также передался апоптоз сперматогенных клеток, и отличающаяся от нормы метиляция ДНК в зонах-промоторах сперматогенеза. Она была найдена у всех самцов линии (в третьем поколении), чьи предки подвергались воздействию.

Заключение и замечания

Гипометилирование мышиного гена агути, вызванное воздействием бисфенола, может быть предотвращено с помощью добавления в диету матери источника метильной группы [29]. Тем не менее, еще предстоит исследовать, можно ли обратить/устранить биоаккумуляцию эпигенетических воздействий после того как прекратилось действие бисфенола и фталатов. Отмечалось передающееся через поколения различие в метилировании ДНК крыс, чьи беременные предки подвергались воздействию смеси бисфенола и фталатов, но синергическое воздействие как бисфенола, так и фталатов остается неопределенным.

Растущее количество данных свидетельствует о том, что эпигенетика обладает значительным потенциалом при разработке биологических маркеров для прогнозирования воздействия на человека химических веществ и индивидуальной восприимчивости к развитию болезни. Всё ещё важно отметить, что механизмы, с помощью которых токсины изменяют эпигенетический ландшафт отдельных клеток, ещё предстоит выяснить. Более совершенные механизмы исследований приведут к лучшему прогнозированию токсического потенциала химических веществ окружающей среды, таких как бисфенол и фталаты, и позволят создать более направленные и подходящие стратегии профилактики заболеваний.

В исследованиях на людях потребуются лабораторные методы с повышенной точностью, чувствительностью и охватом. Их целью должно быть обнаружение эпигенетических изменений как можно раньше, значительно ранее диагностирования болезни. Доступные сейчас новые технологии позволяют проводить глобальный анализ эпигенетических изменений, и они могут дать представление о масштабах и моделях изменений между нормальными и патологическими тканями человека. Следует учитывать соответствующие модели in vitro. В этом контексте человеческие эмбриональные стволовые клетки могут быть чрезвычайно полезными для улучшения понимания эпигенетических эффектов на развитие человека, поддержание здоровья и развитие болезни, поскольку образование эмбриоидных тел in vitro очень похоже на раннюю стадию эмбриогенеза [45, 46].