Как получить максимум от вашего спектрометра
Некоторые спектры выглядят опрятными, некоторые выглядят рваными. Оставив в стороне эстетику – рваные спектры могут скрыть полезные данные и, что ещё хуже, создать ложные данные, такие как ложные пики. Если только нет необходимости работать на абсолютных пределах чувствительности спектрометра, что является редкостью, можно значительно улучшить внешний вид и полезность спектров. Самая большая проблема – шум или, скорее, отношение сигнала к шуму. Чем ниже соотношение, тем хуже выглядят вещи. Когда соотношение опускается примерно ниже пяти, спектры начинают выглядеть действительно плохо.
В современных спектрометрах основным источником шума является вовсе не шум, а доказательство квантовой природы взаимодействия света с веществом. Как мы обсуждали в главе 1, свет имеет много характеристик волны, но обнаруживает себя в дискретных единицах. Таким образом, тусклый свет или короткое время работы детекторов спектрометра очень похожи на землю в начале ливня, и обнаружение фотонов света следует тому же случайному распределению, что и капли дождя. Случайные события такого рода следуют распределению Пуассона, а это означает, что стандартное отклонение равно квадратному корню из среднего. Таким образом, отношение сигнал/шум, являющееся отношением среднего и стандартного отклонений, также равно квадратному корню сигнала `N //sqrt( N ) = sqrt( N )`.
Хотя мы считаем, что фотоны невероятно многочисленны, их число, падающее на крошечный детектор в течение нескольких миллисекунд, невелико. Например, облучённость на безоблачном пляже на закате составляет около 1010 фотонов/см2/с/нм. Спектрометр, оснащённый оптоволоконным кабелем диаметром 200 мкм, имеет область обнаружения 0,00031 см2 (= π × 0,012). За время работы датчика 3 мс этот кабель соберёт около 10 000 фотонов/нм или около 3000 фотонов/канал для спектрометра с разрешением 0,3 нм, который я обычно использую. Однако косинусные корректоры, используемые для измерения энергетической яркости (см. Главу 2), имеют небольшую эффективность. Трубка имеет КПД около 10%, что уменьшает количество фотонов до 300. Это дает отношение сигнал-шум около 17. Это хорошее число, но безоблачный пляж на закате довольно яркий. Многие измерения в биологии предполагают гораздо более низкие уровни освещённости.
К сожалению, нельзя просто без ограничений увеличить время интеграции из-за второго источника шума, называемого «тёмный шум» или «тёмный ток». Детекторы в современных спектрометрах чрезвычайно надежны. Тем не менее, они будут иногда измерять свет, который на самом деле отсутствует, главным образом оттого, что тепловой шум вызывает ложное событие в детекторе. В то время как тёмный шум можно смело игнорировать при значениях интеграции менее одной десятой секунды, при более высоких значениях он становится неприятным (рис. 9.5).
Для 5-секундного времени интегрирования некоторые из каналов будут иметь тёмный шум, равный четверти от общего значения насыщения. Для 10-секундной интеграции многие каналы превысят четверть значения насыщения, а некоторые из них превысят половину. Одна хорошая вещь о тёмном шуме заключается в том, что он характерен для конкретного пикселя. Если регистрирующий свет на 600 нм канал вашего спектрометра имеет тёмный шум в 400 отсчетов за 5 секунд сегодня, он будет иметь примерно одинаковые значения шума завтра (при постоянной температуре). Некоторые пиксели имеют низкий тёмный шум, а некоторые пиксели (часто называемые «горячими») имеют особенно высокий тёмный шум. По этим причинам всё программное обеспечение спектрометра имеет процесс, посредством которого этот шум вычитается из сигнала. Детали меняются, но по существу вы помещаете детектор вашего спектрометра в тёмное место и замеряете спектр. Затем этот спектр вычитается из всех будущих спектров. Количество тёмного шума нелинейно зависит от времени интегрирования, поэтому вам нужно делать новый образец тёмного спектра всякий раз, когда вы сменили время интегрирования. В реальности хорошей идеей является получать новый тёмный спектр, когда вы изменили любые параметры прибора. Он также нелинейно зависит от температуры детектора, которая может меняться, поэтому важно замерять тёмный спектр, всякий раз перед тем, как собирать фактические данные.
Это работает прекрасно, пока время интегрирования не сделать таким большим, что ваше измерение плюс тёмный шум переполнят детектор. Предположим, что ваш детектор насыщается при 4000 отсчетов, и что тёмный шум для канала 600 нм составляет 3000 отсчетов при десятисекундном периоде интеграции. Вы пытаетесь измерить свет, который имеет 2000 отсчетов для 600 нм длины волны. Суммарно получается 5000 отсчетов, но детектор переполнен, поэтому он учтёт только 4000, а затем вычтет 3000 для тёмного шума, оставляя вас с неправильным измерением в 1000 отсчетов. На самом деле, даже до того, как вы доберетесь до переполнения, вариации в тёмном шуме сделают спектр беспорядочным. На моем спектрометре предел времени интегрирования составляет около 10-20 секунд
Так как тёмный шум в основном имеет тепловое происхождение, охлаждение матрицы детектора уменьшает его. Однако это вызывает другие проблемы, такие как конденсация и более высокое энергопотребление (что может быть проблемой в полевых условиях). Помните также, что тепловой шум зависит от градусов по шкале Кельвина, поэтому охлаждение спектрометра от комнатной температуры до точки замерзания снижает соответствующую температуру только на 7%.
Так что же делать? К счастью, существуют два решения, и оба включают усреднение. Какое из них использовать, зависит от того, чем вы готовы пожертвовать – спектральной чувствительностью или временной чувствительностью. Самое простое решение – усреднить соседние каналы. Большинство спектрометров обычно имеют разрешение, составляющее по меньшей мере три канала на нанометр, а это больше, чем требуется большинству биологов. Спектральное распределение в естественном мире обычно намного более плавное. Фактически, исследования статистических свойств естественных спектров (пород, деревьев, животных и т.д.) показали, что требуется учесть всего три-четыре основных компонента спектра для получения более 95% вариаций (Chiao et al., 2000). Это означает, что при правильных фильтрах над четырьмя детекторами можно воссоздать практически любой естественный спектр, используя только измерения этих детекторов. Считается, что именно поэтому у большинства животных имеется не более четырех зрительных пигментов. Таким образом, снижение разрешения с 0,3 до 2 нм не имеет большого значения.
Усреднять соседние каналы можно и при сборе данных. Большинство версий спектрометрического программного обеспечения называют это «boxcar-ing» (boxcar integrator). Всё, что нужно сделать, это ввести количество каналов, которое вы хотите усреднить. Однако я бы настоятельно не рекомендовал бы вам это делать. Всегда можно усреднить соседние каналы позже, в программе для работы с электронными таблицами, но, если сделать это при сборе данных, восстановить исходные значения уже не получится никогда. Возможно вы думаете, что исходные данные вам больше не понадобятся, но жизнь всегда найдёт способ вас удивить.
Другим решением является усреднение множественных спектров по времени. Это позволит иметь время интегрирования настолько большое, насколько нужно, не беспокоясь о переполнении детектора или возникновении ужасного тёмного шума. Конечно, решение не подходит для краткосрочных событий, но для стабильных источников света спектральное усреднение весьма полезно. Тем не менее, существует последний источник шума, ограничивающий то, что вы можете сделать. Этот шум, называемый «шумом считывания данных», происходит, когда сигнал передается от детектора на компьютер. Из-за этого шума усреднение даже большого количества спектров не поможет, если у вас есть спектр с особенно низкими значениями (скажем, 1%-5% от переполнения детектора). Другими словами, среднее значение экспозиции «сто за 10 мс» не обязательно даст вам одно и то же отношение сигнал/шум, как и среднее значение экспозиции «десять за 100 мс», даже если оба значения имеют время интегрирования в одну секунду. Я узнал об этом несколько лет назад после многих болезненных телефонных разговоров с инженером в компании, где я купил один из моих спектрометров. Поэтому, прежде чем даже думать об усреднении, нужно получить достаточно света в спектрометр, чтобы у него было что-то полезное для усреднения. Основное правило состоит в том, чтобы увеличить время интегрирования и диаметр волокна настолько, насколько это возможно, и затем, если в этом всё ещё есть необходимость, усреднять спектры. Как и в случае с boxcar-ing, лучше всего сохранить все ваши спектры и усреднить позже, в программе для работы с электронными таблицами. Но всё же делайте это по необходимость. Если стоит задача усреднить десятки спектров, пусть это делает программное обеспечение спектрометра.
Одно окончательное предупреждение об усреднении: независимо от того, усредняете ли вы по каналам или по времени, помните, что отношение сигнал/шум (т.е. опрятность вашего спектра) пропорционально только квадратному корню из числа усреднений. Поэтому boxcar-ing по девяти каналам только в три раза увеличит соотношение сигнал/шум, а усреднение 100 спектров только увеличит отношение сигнал/шум в десять раз. Таким образом, хотя путем усреднения можно конвертировать то, что кажется полным мусором в чистый спектр, цена этого может быть слишком высока. Мое эмпирическое правило заключается в том, что независимо от того, что вы измеряете, коммерческие многоканальные спектрометры обычно перестают работать примерно на тех же уровнях освещённости, при которых мы переключаемся с цветного зрения на чёрно-белое. Поэтому, если вы хотите измерить освещённость ночных пейзажей, биолюминесценцию или другие тёмные события, вам нужно будет потратить в десять раз больше денег и заполучить машину получше.
Последний вопрос для рассмотрения – стабильность. За исключением облучённости, оптические измерения очень чувствительны к геометрии. Другими словами, если ваш источник света, детектор или цель даже незначительно перемещаются, результаты ваших измерений могут измениться на порядок. Прежде чем действительно начать собирать спектры, вы должны увидеть это сами. Подключите оптоволоконный кабель к вашему спектрометру и направьте его на луч фонарика. Подвиньте и поверните конец кабеля и посмотрите, что происходит с спектром. Если мы с вами похожи, то вы тоже впадёте в депрессию от того, насколько сильно влияют даже небольшие движения. Поскольку глаза логарифмичны, нам часто нужно знать абсолютные измерения с точностью до порядка. Однако многие важные измерения, такие как передача, отражение и рассеяние, нормализуются с помощью эталонного измерения. Если параметры вашей оптики изменились между эталонным измерением и фактическими тестовыми измерениями, последние будут бесполезными.
Таким образом, всё должно быть надёжно смонтировано. Хотя можно записывать данные в чрезвычайной ситуации, вы будете удивлены, насколько плохими будут результаты. Для получения действительно стабильных результатов вещи должны быть закреплены в зажимах, установленных на листе металла. Производители оптики изготавливают листы с предварительно просверленными отверстиями под названием «макеты», которые необходимы для проведения оптических измерений. Вы можете купить гигантские оптические таблицы более чем за 10 000 долларов, но для большинства задач подойдут листы 1 × 2 фута (30.5 см) за 100 долларов. С помощью одного из них и небольшого набора зажимов, винтов и стержней можно настроить площадку под практически любые измерения. Однако это требует изобретательности. Я обычно говорю людям, что оптическое измерение состоит из 99% настройки и 1% измерения. Сильно поможет, если вы выросли среди наборов конструкторов. Неудивительно, что крепления для оптических установок часто называются «Лего».
Выходная мощность источника света должна быть такой же стабильной, как и монтаж установки. Нет смысла строить Форт-Нокс оптических установок, а затем включать его через фонарик с садящейся батареей. Опять же, логарифмическая природа нашего видения скрывает истинную изменчивость многих источников света. Лампы накаливания медленно становятся ярче в течение первых пятнадцати минут, по мере того как вся лампа достигает равновесной температуры. Питание как от батарей, так и от сети подвержено капризам источников питания, а некоторые источники света, такие как дуговые лампы, по своей природе нестабильны.
Лучшим решением является покупка источника света, предназначенного для оптических измерений и имеющего стабилизированный источник питания. Вторым лучшим решением, также работающим достаточно хорошо, является частая (каждые пять-десять минут) проверка стабильности вашего источника питания, и взятие нового контрольное измерение, если показатели плавали.
Наконец, если только вы не работаете в тёмном помещении, уровень освещенности окружающей среды может измениться и повлиять на ваши измерения. Работа в темноте не слишком приятное занятие, поэтому лучше всего спроектировать установку, минимизирующую влияние света в комнате. Можно либо закрыть установку во время измерения, либо гарантировать, что экспериментальный свет является гораздо более доминирующим фактором на детекторе. Тем не менее, солнце может выскочить из-за облаков и вмешаться даже самый тщательный план. Одна из моих студентов измеряла отражательную способность клешней сотен синих крабов в расположенном на пляже навесе краболовов и, к сожалению, позже обнаружила, что чёрная ткань, которую она использовала чтобы закрыть свет солнца, была не такой чёрной, как она надеялась. Данные были непоправимо потеряны.
Итак, к фактическим измерениям. В моем собственном рейтинге возрастания сложности они располагаются так: отражательная способность, передача, облучённость, энергетическая яркость и рассеивание. Измерения отражательной способности, передачи и рассеивания нормализуются простыми стандартами и не требуют абсолютной калибровки спектрометра. Абсолютные облучённость и энергетическая яркость требуют абсолютной калибровки, что делает их более сложными. Измерения рассеивания являются наиболее сложными из-за ряда вопросов геометрии и чувствительности, которые я буду обсуждать в этом разделе.