Измерение отражательной способности
В отношении измерений отражательной способности и коэффициента пропускания хорошо то, что они являются безразмерными, а это значит, что вам не нужно беспокоиться о калибровке вашего спектрометра. Однако это преимущество часто перевешивается проблемами геометрического характера. С отражательной способностью особенно большие проблемы в этом отношении.
Существует несколько разных подтипов отражательной способности, но наиболее полезной для биологов является энергетическая яркость освещенного объекта, нормализованная к энергетической яркости идеального диффузного отражателя, освещённого тем же светом. В этом простом описании не учитывается тот факт, что это соотношение зависит как от того, откуда приходит падающий свет, так и от того, куда вы поместили оптоволоконный детектор. Таким образом, чтобы полностью описать отражательную способность материала, вы должны измерить её для каждого угла падения и каждого угла обнаружения, любых возможных в полусфере. Даже игнорируя зависимость от длины волны (которая всегда присутствует), вы получаете четырехмерного монстра данных, известного как «двулучевая функция отражательной способности» (ДФОС). Как вы могли догадаться, измерение ДФОС требует много времени, и даже ещё больше чтобы понять, что же вы намеряли. Если у вас нет отчаянной потребности в таком уровне информации (и вы работаете с чем-то плоским и неизменным), оставьте эту работу людям, у которых есть на это деньги, и которые на самом деле смогут использовать эти данные, например, компьютерные аниматоры вроде студии Pixar и разработчики удалённых зондирующих спутников из NASA.
К счастью, для большинства биологических объектов (оставим в стороне структурные цвета) отражательная способность может быть достаточно хорошо аппроксимирована как сумма диффузной и зеркальной отражательных способностей (рис. 9.6). Это означает, что одна часть света будет достаточно равномерно отражать во всех направлениях, а остальной свет будет отражаться от поверхности как от зеркала, следуя классическому правилу «угла падения, равного углу отражения». Обычно я рисую условный шар света с одним шипом. Однако отношение диффузного к зеркальному отражению в биологических материалах может варьироваться от нуля (зеркала в глазах гребешков) до одного (пыльные верблюды).
Самый простой способ измерения отражательной способности – осветить измеряемую поверхность, и использовать детектор для измерения того, сколько света отскакивает от неё. При стандартной процедуре свет падает прямо на поверхность, а отражённый свет измеряется на угле 45 °. Таким образом, детектор не фиксирует какого-либо света, зеркально отражённого от источника.
Источник света может быть простым, как фонарик, но он должен обладать достаточной мощностью во всех необходимых вам диапазонах волнах. Например, вы не сможете измерить ультрафиолетовое отражение без выходящего из вашего источника света ультрафиолетового излучения. Компьютер с радостью даст вам цифры, но это будет мусор.
Свет также должен равномерно освещать соответствующую область, что может потребовать диффузора. Коллимирование света путём помещения выпуклой линзы точно на фокусном расстояние от источника также хорошо работает. Детектор должен видеть только освещённую область. Любые неосвещенные области в поле зрения детектора уменьшают измеренную отражательную способность (он учтёт увиденные тёмные области). Поскольку ваш детектор обычно является оптоволоконным кабелем, удобный способ определить его поле зрения – пролить свет сквозь него, просто подключив лампу там, где обычно подключается спектрометр. Освещаемая область также является полем зрения спектрометра. Этот простой трюк, основанный на том, что свет не заботится о пути, которым он идёт, привел к созданию отражающих детекторов. Эти детекторы представляют собой параллельные пучки оптоволокна; одни освещают поверхность, остальные снимают результаты. Они удобны, но, поскольку их перемещение изменяет как расстояние от источника света, так и расстояние получения результатов, небольшие изменения положения детектора могут существенно повлиять на измерения. Используйте их только в том случае, если они закреплены на месте.
Если у вас есть 1500 долларов, а поверхность, которую вы хотите измерить, достаточно плоская и не менее одного сантиметра в поперечнике, используйте интегрирующую сферу со встроенным источником света (рисунок 9.6). Этот умный гаджет освещает вашу поверхность, а затем собирает отражённый во всех направлениях свет, часть из которого фиксируется оптоволоконным кабелем, установленным внутри сферы. У меня есть приятное дополнение – рычаг – который открывает и закрывает световую ловушку, удаляющую весь отражённый зеркально свет. Таким образом, вы можете сначала измерить весь отражённый свет, а затем только диффузно отраженный свет. Разница между этими двумя показателями – зеркально отраженный свет.
Конечно, всё, что записывает детектор – это уровень освещенности. Чтобы рассчитать отражательную способность, вам необходимо нормализовать освещённость к энергетической яркости объекта, являющегося идеальным диффузным отражателем. Этот эталонный образец отражает весь попадающий на него свет, и его энергетическая яркость с любого направления взгляда всегда равна значению облученности падающего света, делённой на π. Большинство людей используют вспененную версию тефлона с микроскопическими порами под названием «Spectralon». Это запатентованный материал и не дешевый, около 300 долларов США за стандартный эталонный образец диаметром в один дюйм, но он незаменим и не имеет срока годности. Чтобы использовать его, вы фиксируете свет, отражающийся от эталонного образца, а затем жмёте кнопку в программном обеспечении, сообщающую компьютеру что данный уровень освещенности означает 100% отражательной способности. После этого можно двигаться дальше.
Если ваш источник света имеет стабильный выход, а он и детектор не перемещаются, измерения отражающей способности – это самые простые оптические измерения. Однако есть пара потенциальных ловушек. Во-первых, многие вещи не так непрозрачны, как вы думаете. Например, в моей лаборатории часто работают люди, измеряющие отражающую способность цветов. В то время как цветки кажутся непрозрачными, многие фактически передают ощутимое количество света. Поэтому измеренная отражательная способность зависит от того, что находится за цветком. Если положить цветок на белый стол, то вы замеряете сумму двух вещей: (1) свет, отраженный от цветка, и (2) свет, проходящий через цветок, отраженный столом, а затем прошедший через цветок снова. Один из способов обойти это – поставить цветок над отверстием в закрытом со всех сторон чёрном ящике. Свет, который передается через цветок, в основном будет поглощён стенками ящика. Более портативное решение – поставить цветок на что-нибудь «чёрное». Обычный чёрный кусок бумаги не сработает, поскольку его отражательная способность обычно составляет не менее 5%. Я часто использую фильтр видимого света, так как в них используется высокая концентрация соединений, сильно поглощающих видимый свет. Пока вы стремитесь избежать зеркального отражения, эти фильтры – отличные переносные ловушки для света. Бумага, как правило, поглощает УФ, поэтому комбинация фильтра видимого света/бумаги эффективно поглощает весь свет от 300 нм до 700 нм.
Биологи, работающие в водной среде, сталкиваются со второй проблемой, заключающейся в том, что отражательная способность объекта зависит от того, находится ли он под водой. Для этого есть несколько причин, некоторые из которых мы обсуждали в предыдущих главах, но суть в том, что отражательная способность сухого и влажного объекта не обязательно одинакова. Между ними нет простой взаимосвязи. Конечно, можно делать все измерения под водой, но это неудобно. Кроме того, Spectralon не мокнет и, следовательно, может выглядеть под водой блестящим, поскольку он собирает пузырьки воздуха на своей поверхности. Подводная отражательная способность спектралона была измерена (Voss and Zhang, 2006), но поскольку он больше не является идеальным диффузным отражателем, он, следовательно, не идеален в качестве стандарта.
Дунтли (Duntley, 1952) придумал простое решение: покрыть объект тонкой плёнкой воды и измерить его отражательную способность на воздухе. Вам придётся подстраивать полученные значения, поскольку что сама плёнка воды уменьшает измеренную отражательную способность. Это происходит потому, что не весь отражённый от объекта свет возвращается через водную пленку. Часть света внутренне отражается несколько раз, причем каждый раз, когда свет опять попадает на объект, происходит некоторое поглощение. Чем ниже отражательная способность объекта, тем выше его поглощение и тем больше будет потеря. Для обычной геометрии измерения, когда источник света перпендикулярен поверхности объекта, а детектор находится на 45°, коррекция:
9.1
где Rw – измеренная отражательная способность влажного объекта на воздухе, а Rsubmerged – отражательная способность, действительно имевшая бы место под водой. Это уравнение примерно удваивает низкую отражательная способность и оставляет высокую отражательную способность почти неизменной. Это решение было тщательно протестировано и подтверждено (Petzold and Austin, 1976), но важно помнить, что все испытания проводились на окрашенных металлических предметах, а не на рыбе. Как говорится, пробег может отличаться.
Зеркальные и обладающие иризацией поверхности создают множество проблем и, откровенно говоря, являются кошмаром для измерений. Это связано с тем, что измеренная отражательная способность критически зависит как от угла падения света, так и от угла измерения. Измените тот или другой на градус, и значения могут увеличиваться или уменьшаться в десять или более раз. Хуже того, изменение геометрии влияет не только на общую энергетическую яркость измеряемого света, но и на спектр. Другими словами, нельзя даже предполагать, что вы поймали при измерении правильный цвет. Если вы часто смотрели на зеркальные и переливающиеся поверхности, это не должно удивлять. Любой наклон предмета или движение головы – и всё выглядит по-другому. Поэтому относитесь к результатам измерений отражательной способности этих видов объектов с максимальной долей скептицизма. Вариации настолько велики, что даже среднее значение из сотен измерений может всё же оказаться бесполезным.
Последняя проблема заключается в том, что измерение отражательной способности малых объектов затруднено. Волоконно-оптические кабели становятся настолько узкими, что их трудно разместить правильно. Например, у меня была студент, желавшая измерить спектральную отражательную способность лапок прыгающих пауков. Они не только маленькие, но они цилиндрические и ещё чуть-чуть блестящие, поэтому положение кабеля имело решающее значение. После долгих раздумий мы решили, что любые полученные нами данные не будут надежными. Вместо этого мы решили использовать микрофотографию. По сути, мой ученик сфотографировала лапки паука через микроскоп, стараясь включить в каждое изображение набор миниатюрных эталонов отражательной способности, в этом случае ряд серых квадратов с известными значениями отражательной способности. Ряд квадратов позволил ей создать кривую калибровки для каждого изображения, с помощью которой преобразовать значения серого от 0 до 255 для каждого цветового канала (красного, зелёного и синего) в отражательную способность. Созданная для каждого изображения кривая должна была учитывать нелинейность камеры (т.е. двойное значение серого не означает увеличения энергетической яркости в два раза), а также изменения освещения, экспозиции, баланса белого камеры и т.д. Очевидным недостатком этого метода является то, что вы получаете отражательную способность, усреднённую только по трём большим полосам длины волны, но это лучше, чем ничего. Если вы одарены усидчивостью, то можете приспособить монохромную камеру с вращающимся набором фильтров, чтобы выбрать для работы любой набор интервалов длин волн, которые вам нравятся. Этот способ создает огромные объёмы трудно интерпретируемых данных, но такое делалось с успехом (например, Chiao et al., 2000)