Типы спектрометров
Первый вопрос - покупка правильной вещи. Опять же, названия запутывают. Для большинства биологов спектрометр представляет собой тяжелую коробку, которая никогда не перемещается со своего места на стойке в лаборатории молекулярной биологии. Эти устройства, также называемые «спектрофотометрами» (несмотря на отсутствие связи с фотометрическими единицами), измеряют спектры поглощения растворов в кюветах. Они бесполезны для любых других спектральных измерений. Более полезным является спектрорадиометр, в свою очередь, также называемый «спектрометром». Центральное отличие состоит в том, что детектор спектрофотометра измеряет путь света внутри машины, а детектор спектрорадиометра обращён к внешнему миру. Спектрорадиометры также, как правило, намного меньше и дешевле. Чтобы сэкономить на слогах, с данного момента я буду называть «спектрометрами» спектрорадиометры.
Спектрометры бывают двух вариантов действия: сканирующие и многоканальные. В то время как все спектрометры воспринимают входящий свет и разделяют его на радугу (почти всегда используя дифракционную решётку), варианты действия отличаются тем, как обнаруживается свет этой радуги (рисунок 9.2). Сканирующие спектрометры светят радугой на чёрную стену с небольшой щелью. Фиксируется только часть радуги, проходящая через щель. Весь спектр фиксируется за счёт поворота дифракционной решётки, в результате чего вращается радуга, и, следовательно, спектральная область, проходящая через щель. Таким образом, спектр сканируется в течение определенного периода времени.
У такого подхода есть некоторые преимущества. Во-первых, спектрометру нужен только один детектор, который может быть большим и, следовательно, более чувствительным. Во-вторых, поскольку щель отсекает почти весь посторонний свет, сканирующие спектрометры минимизируют так называемый «рассеянный свет». Несмотря на то, что внутренности спектрометров окрашены в чёрный цвет и имеют другие меры предосторожности, свет одного цвета может начать отскакивать внутри прибора, и оказаться в неправильном месте. В частности, он может быть зафиксирован как свет другой длины волны. Даже небольшое количество блуждающего света может испортить измерения для слабых длин волн. Это особенно сеет хаос в измерениях УФ-излучения в присутствии гораздо более яркого видимого света. Таким образом, полноспектральные измерения солнечного излучения часто выполняются с помощью сканирующих спектрометров.
Наконец, и, самое главное, сканирующий спектрометр может изменить своё усиление во время сканирования. Многие спектры естественной облучённости могут меняться на порядок для разных длин волн. Например, в солнечный день нисходящая облучённость для 300 нм может быть от сотен до тысяч раз меньше, чем для 450 нм. Таким образом, коэффициент усиления, который хорошо работает для света с длиной волны 450 нм, может сделать значение света с длиной волны 300 нм неотличимым от шума. Аналогично, подходящий для 300 нм коэффициент усиления почти наверняка приведёт к переполнению детектора светом на 450 нм, или даже выведет детектор из строя. Переменное усиление решает эту проблему, что приводит к получению спектров без помех в больших диапазонах интенсивности света.
Но сканирующие спектрометры также имеют значительные проблемы, и возможно, худшей из них является медленная работа. Сканирование занимает по крайней мере несколько секунд, а при низких интенсивностях света может занимать до двадцати минут. Однажды я провёл несколько часов в подводной лодке на глубине 500 метров, ожидая, пока сканирующий спектрометр сделает свои измерения. Это утомительно, но, что более важно, может привести к искажению спектра, если во время сканирования изменяются уровни света или оптические свойства объекта ваших наблюдений. В том же круизе мы отключили все огни на корабле, чтобы зафиксировать свободный от светового загрязнения спектр облучённости безлунной ночью. Сканирование спектра было почти выполнено, когда подбежал капитан с фонариком, и сообщил, что к нам быстро приближается корабль береговой охраны (они посчитали, что мы погасили огни, поскольку перевозили наркотики). Спектр выглядел хорошо до 600 нм (пока он не появился с фонариком), а затем пошёл вразнос.
Сканирующие спектрометры также, как правило, более крупные и дорогие, как минимум в десять раз. Таким образом, если вам не критична высокая чувствительность или низкий уровень блуждающего света, лучшим выбором являются многоканальные спектрометры.
Многоканальные приборы не имеют щели перед детектором, и вместо этого светят весь спектр входящего света на ряд детекторов, как правило, на ПЗС-матрицу или ряд фотодиодов. Это означает, что весь спектр регистрируется сразу, в течение короткого периода времени, равного 3 миллисекундам. Как можно догадаться, преимущества и недостатки противоположны преимуществам сканирующей системы. Многоканальные системы обычно менее чувствительны, поскольку детекторы меньше. Однако для улучшения чувствительности прибор может усреднить множество спектров. Это может сделать получение значений такими же медленными, как у сканирующих систем, но поскольку значение для каждой части спектра собрано в течение короткого периода времени, изменения уровней света во время длительного сбора усредненных сканирований не так сильно искажают спектр. Большая проблема заключается в том, что многоканальные спектрометры имеют постоянный коэффициент усиления для всего спектра. Это, в сочетании с гораздо большим количеством блуждающего света означает, что они имеют меньший динамический диапазон, обычно от 250: 1 до 1000: 1 в идеальных условиях. Поэтому если интенсивность самой яркой длины волны во много раз превышает интенсивность самой тусклой длины волны, вы не сможете измерить хорошо их обе. Низкий коэффициент усиления превратит тусклые длинны волн в шум; высокий коэффициент усиления переполнит детектор более яркими длинами волн. Хотя это не слишком большая проблема для работы в помещении, для измерений на отрытом воздухе это может быть настоящей болью. Несмотря на подобную проблему, многоканальные инструменты, как правило, являются лучшим выбором для биолога.
Существуют две гибридные системы, которые сочетают в себе некоторые преимущества сканирующих и многоканальных спектрометров. Первыми являются многодиапазонные радиометры. Хотя они и не являются спектрометрами как таковыми, они функционируют как грубые их варианты, имея от 5 до 10 спектрально-избирательных каналов, обычно шириной 10-20 нм в, расположенных по диапазону длин волн. Эти каналы имеют свои собственные переменные коэффициенты усиления, а также фильтры, которые делают их чрезвычайно избирательными. Системы такого типа часто используются для измерения УФ-излучения, поскольку не только естественное ультрафиолетовое излучение гораздо тусклее видимого свет, но и ультрафиолет Б тусклее ультрафиолета А. Одна из таких систем, PUV-500 от Biospherical, имеет шесть каналов шириной 10 нм с центрами в 305 нм, 313 нм, 320 нм, 340 нм, 380 нм и 395 нм в дополнение к датчику ФАР. Помимо очевидной потери спектрального разрешения, другим большим недостатком является то, что многодиапазонные радиометры, как правило, стоят столько же, сколько сканирующие спектрометры. Другой инструмент, известный как «оптический многоканальный анализатор» (ОМА), представляет собой многоканальный спектрометр с системой интенсификации перед детекторным массивом. Это делает их такими же чувствительными, как сканирующие системы, но без проблем спектрального искажения. Хотя они замечательно подходят для измерений переменного и тусклого света, например, биолюминесценции, эти приборы чрезвычайно дороги, примерно 100 000 долларов.
Несмотря на то что сканирующие, многодиапазонные и оборудованные системой интенсификации спектрометры необходимы в некоторых случаях, они обычно не являются лучшей покупкой, особенно в случае первого спектрометра, или если цена и мобильность устройства являются серьезными соображениями. Конечно, потребности измерения света в биологии могут быть такими же разнообразными, как и сама биология. Однако, по моему опыту, многоканальные спектрометры являются лучшим выбором для более чем 90% задач, и остальная часть этой главы относится к ним.