Флуоресценция
Это не офис. Это Ад с флуоресцентным освещением.
– Автор неизвестен
Флуоресценция не создаёт свет! Я ждал этого шесть глав, и, наконец, выпалил. Меня не многое раздражает – я нахожу раздражение раздражающим – но вот это считается. Заблуждение существует в двух вариантах. Первое – это распространенное неправильное употребление терминов. Исторически биолюминесценция часто соотносилась с фосфоресценцией, и многие люди, даже биологи, по-прежнему считают термины синонимичными. До сих пор в туристических брошюрах для местных источников биолюминесценции эти достопримечательности описывают как, например, «фосфоресцирующие заливы», что совсем не способствует прояснению ситуации. Ещё к большему сожалению, поскольку фосфоресценция тесно связана с флуоресценцией (как мы обсудим в этой главе), последний термин тоже присоединился к вечеринке, и часто используется синонимично с биолюминесценцией. Как раз прошлым вечером я был на ужине, где зоолог беспозвоночных международного уровня описывал флуоресценцию как биолюминесценцию. Многие биолюминесцентные животные используют флуоресценцию для изменения длины волн излучаемого ими света, самым известным примером чего является зелёный флуоресцентный белок. Кроме того, некоторые люциферины являются флуоресцирующими, но основной процесс излучения связан с флуоресценцией слабо. Как мы обсуждали в главе 3, биолюминесценция представляет собой форму хемилюминесценции, в которой конкретные химические реакции приводят к испусканию фотонов в определенном диапазоне энергий и, следовательно, в длинах волн. Это не флуоресценция.
Хотя путаница в терминах повсеместна, и, подобно простуде, возможно никогда не будет изжита до конца, она менее пагубна, чем другое недоразумение. В нём признаётся, что флуоресценция не является биолюминесценцией, но сохраняется вера в то, что флуоресценция способна делать свет. Флуоресценция никогда не сможет сделать свет, она может только убрать его.
Что я подразумеваю под этим? Поскольку мы говорим о свете как в энергетических, так и квантовых терминах, мне нужно быть ясным. Флуоресценция не может добавить к системе больше оптической энергии. Если вы светите на флуоресцентную поверхность с облучённостью один ватт/м2, свет, покидающий поверхность, никогда не сможет превысить один ватт/м2, так как это нарушит закон сохранения энергии. Фактически, обычно поверхность покинет менее одного ватта/м2, поскольку флуоресцентные вещества не на 100% эффективны. Часть энергии преобразуется в другие формы. Однако, если рассмотреть ситуацию в терминах фотонов, то в систему может быть добавлено больше фотонов. Чтобы это сработало, новые фотоны должны обладать более низкой энергией, чем исходные фотоны. Например, кристаллы бета бората бария могут превращать один фотон в два фотона, каждый с половиной энергии исходного. Я не уверен, способны ли на такое какие-либо биологические флуорофоры, потому что испускаемые фотоны обычно имеют энергию ненамного ниже, чем входящие фотоны, но я полагаю, что теоретически возможно существование биологической молекулы, которая увеличивает количество фотонов. Однако даже эта незначительная возможность – совсем не то же самое, что создавать свет.
Несмотря на это, биологи нередко говорят о флуоресценции, как будто её добавление заставляет что-то светиться. Я предполагаю, что в основном это связано с тем способом, как большинство биологов видят флуоресценцию – через флуоресцентный микроскоп. Посмотрите на флуоресцентно маркированную ткань под конфокальным или стандартным флуоресцентным микроскопом, и она действительно выглядит так, будто производит свет. Однако трюк в том, что вы не видите падающего света, возбуждающего флуоресценцию. Часть этого света поглощается флуорофором, а оставшаяся часть (как правило, остаётся много), экранируется высокоселективным фильтром, находящимся между образцом и вашим глазом. Уберите этот фильтр, и всё будет выглядеть гораздо менее впечатляюще.
Сегодняшняя технология фильтрации позволила ученым создавать яркие изображения. Изображения флуоресценции животных, окраски в ультрафиолетовом спектре, двоякопреломляющие ткани или даже иризации гребных пластинок гребневиков прекрасны, если создать правильные фильтры и освещение. Однако в природе такой специальный свет встречается редко, поэтому при оценке экологической значимости оптических свойств животного важно не влюбиться в изображение, и убедиться, что вы понимаете, как животное выглядит при естественном освещении. Звучит очевидно, но многие, а возможно и большинство исследований игнорируют этот важный аспект.
Ладно, оставим проповеди. Итак, если флуоресцентные молекулы не создают света, то что они делают? Прежде всего, флуорофоры являются пигментами, что означает, что они поглощают свет. Однако, в отличие от большинства пигментов, преобразующих всю поглощённую энергию в другие формы, флуорофоры преобразуют только её часть. Оставшаяся энергия испускается как фотон. Обычно этот фотон имеет более низкую энергию и большую длину волны, чем исходный фотон, причем разность энергий известна как «стоксов сдвиг». Однако время от времени фотон может испускаться с более высокой энергией и меньшей длиной волны, чем исходный фотон. Это называется «антистоксов сдвиг». Дополнительная энергия, необходимая для этого, берется из колебательных состояний молекулы, что фактически немного охлаждает её. Это несколько противоречит предыдущему утверждению «флуоресценция не делает света», но антистоксов сдвиг является незначительной частью биологической флуоресценции, поэтому мы его проигнорируем. При очень интенсивном свете также возможно, что некоторые молекулы поглотят два фотона, а затем, объединяя энергии, испустят фотон с более высокой энергией и меньшей длиной волны. На этом принципе основана двухфотонная микроскопия, но я не знаю ни одного животного, которое на такое способно. По крайней мере 99% биологических случаев флуоресценции являются преобразованием одного фотона в другой фотон с более низкой энергией и более длинной длиной волны. Это похоже на неупругое рассеяние, поскольку выглядит как отскакивающий фотон, теряющий энергию в процессе, но этот термин обычно зарезервирован для других процессов, которые мы обсудим в конце этой главы.
Я уверен, что есть способ отобразить флуоресценцию на языке волн, но её почти всегда показывают в квантовой форме с помощью диаграммы энергетических уровней (рис. 7.1).
Фотон поглощается, посылая молекулу на более высокий энергетический уровень. Вместо того, чтобы прыгнуть обратно в основное состояние одним прыжком (и испустить фотон той же длины волны, который мы будем называть рассеянным фотоном), молекула возвращается в основное состояние по меньшей мере в два прыжка, последней из которых обычно приводит к испусканию фотонов. Поскольку это последнее падение энергии меньше первоначального повышения энергии, излучаемый фотон имеет более низкую энергию и большую длину волны. Звучит просто, но никогда не путайте диаграмму с пониманием того, что действительно происходит, особенно в этом случае. Определить энергетические уровни реальной молекулы, а затем выяснить, какие скачки произойдут вероятнее всего и куда пойдёт энергия, затруднительно. Предсказать что-либо из этого на основании базовых принципов почти невозможно. Этими проблемами занимается большая область физики.
Тем не менее отсюда нужно вынести главный факт – хотя флуоресценция не создаёт света, она меняет его состав, что имеет наблюдаемые последствия даже без специальных фильтров, увеличивающих эффект. Однако, прежде чем мы погрузимся в эти последствия, нам нужно познакомится с некоторой терминологией.